（1）稱取1g磨碎的樣品，放入適當(dāng)?shù)娜萜髦校?/div>
（2）加入4mL 1×樣品提取液, 搖勻5秒,再加入250uL清洗液，最大轉(zhuǎn)速漩渦振蕩3min。
（3）室溫（22.5±2.5）°C 4000 rpm離心10分鐘；
（4）取上清250µL于干凈管中，加入250µL 1×樣品平衡溶液。
（5）渦流15秒，4000xg 離心2分鐘。
（6）每孔取50 µL下清液，進(jìn)行樣品測(cè)試。
稀釋倍數(shù)：11（適用于0.2-2.0ppm 的添加回收）
為了檢測(cè)高濃度的樣品，可以在第4步通過(guò)增加 1x樣品稀釋液來(lái)提高稀釋倍數(shù)，例如：加500µL lx樣品稀釋液，稀釋倍數(shù)是22（適用于0.4-4.0ppm添加回收）。
牛奶
（1）取1mL樣品，加入4 mL 1x樣品提取液，搖勻5秒，再加入250uL清洗液，最大轉(zhuǎn)漩渦振蕩30s或手動(dòng)搖勻3min。
（2）常溫4000g離心10min。
（3）取250uL上清于干凈管中，加入250uL1×樣品平衡溶液。
（4）渦流15秒，4000xg 離心2分鐘。
（5）取50μL作檢測(cè)。
稀釋倍數(shù)：11（適用于0.2-2.0ppm 的添加回收）
為了檢測(cè)高濃度的樣品，可以在第4步通過(guò)增加樣品稀釋液來(lái)提高稀釋倍數(shù)，例如：加500µL lx樣品稀釋液，稀釋倍數(shù)是22（適用于0.4-4.0ppm添加回收）。
奶粉/嬰兒配方奶粉
（1）取1g奶粉,加入4mL 1x樣品提取液，渦流30秒勻質(zhì)化樣品。
（2）加入250uL清洗液，最大轉(zhuǎn)速漩渦振蕩30s或手動(dòng)搖勻3min。
（3）常溫4000g離心10min。
（4）取100uL上清液于干凈管中，加入100uL1×樣品平衡溶液。
（5）渦流15秒，4000xg 離心2分鐘。
（6）取50μL作檢測(cè)。
稀釋倍數(shù)：11（適用于0.2-2ppm 的添加回收）
為了檢測(cè)高濃度的樣品，可以在第4步通過(guò)增加 1x樣品稀釋液來(lái)提高稀釋倍數(shù)，例如：加800uL 1x樣品稀釋液，稀釋倍數(shù)是55（適用于0.6-10ppm添加回收）。
巧克力
（1）在玻璃管中稱取1g 巧克力樣品，加入5ml 1x樣品提取液，在50℃水浴中孵育2-3分鐘，最大轉(zhuǎn)速渦流30秒勻質(zhì)化樣品。
（2）加入250uL清洗液，最大轉(zhuǎn)速漩渦振蕩30s或手動(dòng)搖勻3min。
（3）常溫4000g離心10min。
（4）取100uL上清液于干凈管中，加入100uL1×樣品平衡溶液。
（5）渦流15秒，4000xg 離心2分鐘。
（6）取50μL作檢測(cè)。
稀釋倍數(shù)：11（適用于0.2-2ppm 的添加回收）
為了檢測(cè)高濃度的樣品，可以在第4步通過(guò)增加 1x樣品稀釋液來(lái)提高稀釋倍數(shù)，例如：加500uL 1x樣品稀釋液，稀釋倍數(shù)是22（適用于0.4-4ppm添加回收）。
酸奶/黃油/酸乳
（1）稱取0.5g 樣品，加入0.5ml 1x牛奶提取液，混勻。最大轉(zhuǎn)速漩渦振蕩30s或手動(dòng)搖勻3min。
（2）常溫4000g離心10min。
（3）取200uL上清液于干凈管中，加入800uL1×樣品稀釋溶液。
（4）渦流15秒，4000xg 離心2分鐘。
（5）取50μL作檢測(cè)。
稀釋倍數(shù)：10（適用于0.2-2ppm 的添加回收）
為了檢測(cè)高濃度的樣品，可以在第4步通過(guò)增加 1x樣品稀釋液來(lái)提高稀釋倍數(shù)
試劑準(zhǔn)備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配制：
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先將2000 ppb標(biāo)準(zhǔn)品（200µL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至128 ppb（例：64µL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+936µL的1×稀釋液，制備得到1000μL的128 ppb濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將128 ppb標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：128 ppb、64 ppb、32 ppb、16 ppb、8 ppb、4 ppb、2 ppb，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ppb)。
一抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標(biāo)二抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：
如樣本中待測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測(cè)樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲(chǔ)存，且避免反復(fù)凍融。（若實(shí)驗(yàn)在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實(shí)驗(yàn)為長(zhǎng)時(shí)間跨度實(shí)驗(yàn)，建議將標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性）
實(shí)驗(yàn)步驟
所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測(cè)
1.樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品/預(yù)處理過(guò)的待測(cè)樣品，同時(shí)加入抗試劑50µL/孔（加抗試劑時(shí)請(qǐng)使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動(dòng)30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
2.二抗孵育：每孔加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗方式清洗4次。
3.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時(shí)請(qǐng)使用多道移液器，根據(jù)樣品和對(duì)照抗體的顏色，自行控制顯色時(shí)間）
4.終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時(shí)請(qǐng)使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為2 ppb。
線性關(guān)系
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.999。
交叉反應(yīng)性
三聚氰胺：100%
實(shí)驗(yàn)步驟匯總
1.加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和一抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌3次。
2.加酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計(jì)算
以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
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