T150燒瓶 : 07-200-64
T75燒瓶 : 10-126-37
冷 凍 劑 : 03-374-059
45um過(guò)濾器 : 09-754-21
05%胰蛋白酶 : sh30236.01
25%胰蛋白酶 : sh30042.01
惰性譜線 : MOC1,22
侵略性線 : MOC2
IMDM : sh30228.02 Hams
營(yíng)養(yǎng)混合物 : F10-F12sh30026.01胎牛血清，特征-海克隆
目錄 / 批次號(hào) : sh30071.03 / AWK24001
過(guò)濾1L過(guò)濾器瓶的過(guò)濾器 : 09-761-108
科學(xué)試劑目錄編號(hào) : 胰島素：I6634-50mg 氫化可的松：H0135-1mg
EMD微孔試劑目錄編號(hào) : 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，重組人：01-107
解凍細(xì)胞系
1. 在解凍前，將21ml IMDM MOC線培養(yǎng)基加入到T150中(如果想解凍成T75，則將10ml加入到T75 中）
2. 將液氮從冷凍瓶中取出，噴上含有70%酒精的小瓶進(jìn)行清洗。
3. 將冷凍瓶的下半部分放在37攝氏度的水浴中(不讓蓋子接觸水，以避免污染），直到 有一小塊冰漂浮著。
4. 再次用ETOH噴灑冷凍瓶，然后放在引擎蓋上。將1ml培養(yǎng)液移液管加入到1ml細(xì)胞中，并將這 些2ml加入到已經(jīng)含有培養(yǎng)基的T150中(使一個(gè)T150總共有22ml)。
5. 在T150燒瓶中取一些培養(yǎng)基，沖洗冷凍瓶，然后平板放置，以確保所有殘留的細(xì)胞都留在冷 凍瓶中。
冷凍細(xì)胞系
1. 從T150中收集細(xì)胞，如下圖所示
2. 在15ml錐形管中旋轉(zhuǎn)成顆粒(1000 RPM x5分鐘）
3. 排出上清液
4. 點(diǎn)擊15ml圓錐形管，重懸細(xì)胞
5. 加入1.5ml IMDM MOC系培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中重建細(xì)胞-保持冰上
6. 管入冰時(shí)緩慢加入1.5 ml冷凍介質(zhì)(在IMDM MOC線介質(zhì)中制作冷凍介質(zhì)-20%DMSO。例：20ml庫(kù)存-加入16ml IMDM MOC線培養(yǎng) 基和4ml DMSO。注射器過(guò)濾器，使用um過(guò)濾器
7. 每份1毫升到3個(gè)冷凍瓶
8. 在-80攝氏度內(nèi)儲(chǔ)存不超過(guò)2周
9. 在1-2周內(nèi)放入液氮溶液中
注 ： 如果需要，可增加到2ml IMDM和2ml冷凍培養(yǎng)基，以?xún)?chǔ)存在4個(gè)小瓶中。此外，最好在冷凍細(xì)胞 前計(jì)數(shù)細(xì)胞并記錄在小瓶上。
細(xì)胞系特征
1. 惰性- MOC1：基于體內(nèi)研究的侵襲性較低。如果從80%合流T150通過(guò)1：12，需要2-4天才能達(dá)到80%合 流。與更具侵襲性的細(xì)胞系相比，MOC1細(xì)胞系在收獲時(shí)需要的時(shí)間更長(zhǎng)。
2. 侵襲性- MOC2：基于體內(nèi)研究，更具侵襲性。如果從80%合流T150通過(guò)1：12，需要2-4天才能達(dá)到 80%合流。與惰性細(xì)胞系相比，惰性細(xì)胞系更容易從燒瓶中分離出來(lái)。
從T150收集和傳遞細(xì)胞/80%融合
1. 將T150中的介質(zhì)倒入傾倒瓶中
2. 用10-20ml PBS清洗一次。倒出PBS清洗液。
3. 加入1.5ml 0.05%胰蛋白酶，尖端瓶，確保胰蛋白酶覆蓋整個(gè)表面積，從而接觸所有細(xì)胞(這樣做，使細(xì)胞不會(huì)暴露在胰蛋白酶中太久)，排出胰蛋白酶，然后再應(yīng)用1。5ml0.25%胰蛋 白酶。
4. 放置在37C培養(yǎng)箱中。侵襲性細(xì)胞系孵育3-4分鐘，惰性反應(yīng)可達(dá)10-12 min，但在6-8 min后 檢查。
5. 故意敲擊燒瓶一側(cè)的手掌幾次，使細(xì)胞松動(dòng)。
6. 在顯微鏡下檢查，看細(xì)胞在培養(yǎng)基中是否能自由漂浮。如果大多數(shù)沒(méi)有，請(qǐng)放回37C培養(yǎng)箱中 再放置3-5分鐘。盡量不要讓細(xì)胞在胰蛋白酶中停留，因?yàn)檫@樣會(huì)殺死細(xì)胞。
7. 一旦所有或大部分細(xì)胞漂浮，加入10ml IMDM MOC線培養(yǎng)基來(lái)中和反應(yīng)。
8. 移液管培養(yǎng)基和細(xì)胞從燒瓶中進(jìn)入15ml的錐形細(xì)胞到顆粒細(xì)胞。離心機(jī)，1000 RPM x 5 min。
9. 倒出上清液。
10. 以1：12的速度通過(guò)細(xì)胞-在另外12毫升的培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。
11. 從其中取出1ml，放入新的T150燒瓶中，總體積為22ml的IMDM MOC系培養(yǎng)基(稀釋1：12）
1２. 放回37C的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。應(yīng)在2-4天內(nèi)達(dá)到80%的合流率。
注入小鼠側(cè)腹（異位）所需細(xì)胞濃度：
MOC1：MOC22：(用0.15ml注射1e6細(xì)胞）=6.66e6細(xì)胞/ml
MOC2：(用0.15ml注射1e5細(xì)胞)=6.66e5細(xì)胞/ml
1. 用0獲取細(xì)胞。25%的胰蛋白酶，如上所述。
2. 用IMDM MOC系培養(yǎng)基中和胰蛋白酶后，將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)成50ml錐形的顆粒(1000 RPM x5分鐘)。 注：使用50ml錐形，允許小尺寸針抽出細(xì)胞供注射。
3. 用10ml冰水PBS重懸細(xì)胞顆粒(確保盡可能多地去除含有FCS的介質(zhì))，再次將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)成顆 粒(1000 RPM x5分鐘)
4. 用3-6 ml冰PBS重懸細(xì)胞顆粒再次清洗細(xì)胞(體積取決于顆粒的大小，因?yàn)槟銓⑹褂眠@個(gè)體積 來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞）
5. 使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)每毫升的細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)來(lái)消除死亡細(xì)胞。使用 存在的細(xì)胞總數(shù)(細(xì)胞/mlx總PBS的mlPBS)，計(jì)算重懸細(xì)胞顆粒所需的體積，以達(dá)到6.66e6(MOC1，MOC22)或6. 66e5 cell/ml(MOC2)濃度。
例如：MOC1的細(xì)胞計(jì)數(shù)為： 2.8e6細(xì)胞/mlx5ml(PBS)=14e6細(xì)胞總數(shù)。14e6細(xì)胞/ 6.66e6細(xì)胞/ml=2.1mlPBS將細(xì)胞顆粒懸浮在其中。
6. 再次將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)成小顆粒。倒出PBS上清液(不)。在計(jì)算體積的冰PBS中重懸顆粒以達(dá)到 適當(dāng)?shù)臐舛龋涀」嘧⑸锨搴?0ml錐形中還有 200ul。
7. 將50ml錐形冰轉(zhuǎn)移，每只小鼠皮下注射0.15ml(150ul)細(xì)胞。
8. 按照標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議注入鼠標(biāo)。我們用1毫升注射器。我們用1.5英寸21號(hào)針繪制細(xì)胞，并將針切換 到½英寸26號(hào)針進(jìn)行注射。
1L媒體協(xié)議
將培養(yǎng)基為2：1 IMDM制成營(yíng)養(yǎng)混合物
1. 解凍胎牛血清和賓州/鏈球菌在37攝氏度
2. 1L過(guò)濾瓶加入626ml IMDM和313ml營(yíng)養(yǎng)混合物
3. 添加50毫升FCS
4. 添加10ml Penn流
5. 過(guò)濾器
6. 加入1ml5mg/ml胰島素(或500ul，10mg/ml)
注：用10ml無(wú)菌H20稀釋胰島素50mg粉末，加50ul無(wú)菌1N鹽酸，4C箔保存
7. 加入40ug氫化可的松
注：將Sigma中氫化可的松酮稀釋1mg氫化可的松粉制成19ml無(wú)血清IMDM和1ml 100%乙醇，制成20ml。每升使用800ul。在-20處存儲(chǔ)等分。
8. 添加5ug EGF
注：使EGF - make 1ug/ul原液用無(wú)血清IMDM稀釋?zhuān)可尤?ul。在-80處存儲(chǔ)等分。
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