上海酶聯(lián)生物ELISA實(shí)驗(yàn)中不同類型樣本的處理方法
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<div>通常我們用ELISA來檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準(zhǔn)確性的第一步。 </div>
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<div>1、 血清 </div>
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<div>血清是常用于ELISA檢測的一類樣本，處理也比較簡單。用無熱原、無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標(biāo)本，將試管或離心管室溫放置2小時(shí)或4℃一個(gè)晚上，使血清析出。（最好將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出）。4℃1000×g離心20分鐘，仔細(xì)收集上清。建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。 </div>
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<div>采血過程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞裂解時(shí)會(huì)釋放具有過氧化酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標(biāo)記的ELISA檢測中會(huì)有非特異性的顯色，而導(dǎo)致檢測的不準(zhǔn)確性。同時(shí)也應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榫w內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測的假陽性。 </div>
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<div>2、 血漿 </div>
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<div>ELISA實(shí)驗(yàn)用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標(biāo)本，標(biāo)本采集后30min內(nèi)4℃1000×g離心15min，取上清即血漿。將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標(biāo)本。常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測時(shí)還應(yīng)仔細(xì)閱讀試劑盒說明書，檢查試劑盒是否對(duì)抗凝劑有特殊要求。 </div>
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<div>3、 細(xì)胞培養(yǎng)上清 </div>
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<div>取細(xì)胞培養(yǎng)上清到離心管，1000×g離心20min，除去細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。 </div>
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<div>4、 細(xì)胞裂解液 </div>
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<div>（1）吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細(xì)胞，加適量培養(yǎng)基將細(xì)胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細(xì)胞可省略。 </div>
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<div>（2）收集細(xì)胞懸液，1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤洗3次。 </div>
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<div>（3）加入適量的預(yù)冷PBS或細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞量需要150~250μL PBS重懸。 </div>
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<div>（4）將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融幾次，使細(xì)胞充分裂解。也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以達(dá)到裂解的目的。 </div>
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<div>（5）4℃10000×g 離心10min，除去細(xì)胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。 </div>
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<div>5、組織勻漿液 </div>
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<div>（1）將組織樣本用PBS (0.01 [錨點(diǎn)] [錨點(diǎn)] M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。 </div>
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<div>（2）將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小，便于勻漿得更充分。 </div>
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<div>（3）將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時(shí)置于冰上或冰浴中。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，檢測后計(jì)算樣品濃度時(shí)應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)） </div>
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<div>（4）吸取勻漿液到離心管，4℃5000×g 離心5-10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。 </div>
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<div>6、 尿液、唾液等其他液體生物樣本 </div>
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<div>1000×g離心20min，取上清即可檢測。 </div>
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<div>總的來說，因?yàn)镋LISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。為了保證檢測的準(zhǔn)確性，保存于-20℃或-80℃的樣本最好在1-6個(gè)月內(nèi)檢測；4℃保存的樣本應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行檢測。另外，還應(yīng)保證樣本不含NaN3，因?yàn)镹aN3會(huì)抑制HRP的活性，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。 </div>
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