細(xì)胞培養(yǎng)上清液ELISA檢測(cè)的樣品制備方法

對(duì)于細(xì)胞樣品，可根據(jù)目標(biāo)物的位置選擇細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為樣品。由于細(xì)胞樣品存在諸多干擾因素，例如細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、pH值、培養(yǎng)基鹽離子濃度、采樣時(shí)間等，可能會(huì)出現(xiàn)樣品無(wú)法檢測(cè)的情況。如果目標(biāo)物質(zhì)為分泌物且主要在細(xì)胞外，則可選擇細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為樣品。這里我們主要介紹細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品制備的相關(guān)因素。  <img src="/images/upload/Image/微信圖片_20250319113012.jpg" width="300" height="225" alt="elisa試劑盒" /> <h3>    樣品制備方法<o:p></o:p></h3>       1、收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液<o:p></o:p>       使用96、24、6孔板，（貼壁或懸?。┘?xì)、6-10mm培養(yǎng)皿，T25/T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶等時(shí)，（貼壁或懸浮）細(xì)胞密度需達(dá)到60-90%。<o:p></o:p>       懸浮細(xì)胞：在2-8°C下以2500rpm離心5分鐘，收集澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。<o:p></o:p>       貼壁細(xì)胞：直接收集上清，2-8℃、2500rpm離心5分鐘，收集澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清。<o:p></o:p>       2、樣品預(yù)處理<o:p></o:p>       樣品通過(guò)離心、蛋白沉淀等方法進(jìn)行預(yù)處理，以去除可能影響ELISA結(jié)果的干擾物質(zhì)，如細(xì)胞碎片、細(xì)胞殘留物等。可通過(guò)離心將細(xì)胞碎片沉淀，并將上清液轉(zhuǎn)移至新的試管中。<o:p></o:p>       3、稀釋樣品<o:p></o:p>       根據(jù)ELISA試劑盒的建議，上清液可能需要適當(dāng)稀釋，以確保樣品濃度在試劑盒的檢測(cè)范圍內(nèi)。濃度過(guò)高或過(guò)低都可能影響檢測(cè)的靈敏度和線性范圍。<o:p></o:p>       4、對(duì)照樣品<o:p></o:p>       準(zhǔn)備陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品。陽(yáng)性對(duì)照含有已知濃度的目標(biāo)蛋白，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。陰性對(duì)照通常不含目標(biāo)蛋白，用于檢測(cè)非特異性結(jié)合和背景信號(hào)。<o:p></o:p>       5、冷凍樣本<o:p></o:p>       如果無(wú)法立即進(jìn)行ELISA檢測(cè)，可以將樣本冷凍保存，以確保樣本的穩(wěn)定性。冷凍前，請(qǐng)確保樣本不存在因凍融引起的結(jié)構(gòu)變化。盡量避免多次凍融樣本，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解和丟失。<o:p></o:p>       防范措施<o:p></o:p>       單次檢測(cè)每個(gè)樣本的采集體積為100ul。如果對(duì)同一樣本進(jìn)行N次檢測(cè)，則需要N個(gè)100ul的采集體積。如果使用多個(gè)孔，則樣本體積需加倍。<o:p></o:p>       樣本若在一周內(nèi)采集并檢測(cè)，可保存于2-8℃，若未及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)分裝后冷凍于-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。<o:p></o:p>       試劑盒的檢測(cè)范圍不等于樣品中分析物的濃度范圍，建議實(shí)驗(yàn)前通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)估算樣品中分析物的濃度，并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣品的濃度。<o:p></o:p>       標(biāo)本應(yīng)新鮮檢測(cè)。如果存在細(xì)菌污染，細(xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP，也可能產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。如果在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)發(fā)生聚集，導(dǎo)致間接ELISA檢測(cè)背景加深。<o:p></o:p>       反復(fù)凍融會(huì)降低蛋白滴度，因此若待測(cè)樣本需要多次檢測(cè)，應(yīng)單獨(dú)包裝冷凍保存。<o:p></o:p>

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