告別廢數(shù)據(jù)！ELISA吸光度測(cè)量的"黃金法則"
<div><span style="font-size: 12px;"> 吸光度（A），又稱光密度（OD）。OD值這個(gè)概念，做實(shí)驗(yàn)的朋友們想必都很熟悉。從判斷提取核酸的質(zhì)量和濃度，到BCA蛋白定量進(jìn)行蛋白定量，或是ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的含量，這些常用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)都需要測(cè)試樣品的“OD值”，但“OD值”究竟是什么？測(cè)“OD值”時(shí)我們需要注意哪些問(wèn)題呢？今天我們就來(lái)聊聊這里。</span></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> </span><strong><span style="font-size: 12px;">什么是“OD”值？</span></strong></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> OD（OpticalDensity）的縮寫(xiě)，即光密度，也可以稱為吸光度。吸光度是指利用物質(zhì)特有的吸收光譜來(lái)識(shí)別物質(zhì)或測(cè)定其含量。將特定波長(zhǎng)的光束照射到待檢測(cè)物體上，待檢測(cè)物體會(huì)吸收部分光，通過(guò)吸光度計(jì)算出待檢測(cè)物體的濃度值。一般來(lái)說(shuō)，待檢測(cè)物質(zhì)的濃度越高，吸光度值就越高。實(shí)驗(yàn)中，也會(huì)利用“OD值”與待檢測(cè)物質(zhì)濃度之間的關(guān)系來(lái)確定吸光度。</span></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> </span><strong><span style="font-size: 12px;"> “OD”值檢查工具</span></strong></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> 酶標(biāo)儀，即酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，用于檢測(cè)ELISA反應(yīng)后的吸光度值。它主要由光路系統(tǒng)和信號(hào)采集系統(tǒng)組成。其工作原理為：</span></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> 光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過(guò)濾光片或單色器轉(zhuǎn)變?yōu)橐皇鴨紊?，一部分單色光被?biāo)本吸收，另一部分透射過(guò)標(biāo)本照射到光電探測(cè)器上；</span></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> 光電探測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號(hào)，經(jīng)過(guò)一系列的信號(hào)處理后，送入微處理器進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計(jì)算，最后將結(jié)果顯示出來(lái)。</span></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> </span><strong><span style="font-size: 12px;"> 實(shí)驗(yàn)中測(cè)量“OD值”的注意事項(xiàng)</span></strong></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> 測(cè)量時(shí)最需要注意的是光的波長(zhǎng)。在介紹“OD值”這個(gè)概念時(shí)提到，吸光度利用的是物質(zhì)特有的吸收光譜。實(shí)際操作中我們需要注意的正是這一點(diǎn)。不同物質(zhì)的吸收光譜不同，最大吸收峰的波長(zhǎng)也不同。為了達(dá)到最佳的測(cè)量效果，一般來(lái)說(shuō)，我們需要在待測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)其“OD值”。例如，核酸在260nm波長(zhǎng)處吸收最大光，而蛋白質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處吸收最大光。用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量時(shí)，顯色反應(yīng)后溶液由淺綠色變?yōu)樽仙?，此時(shí)在560nm處有一個(gè)最大吸光值；在采用TMB法的ELISA實(shí)驗(yàn)中，加入終止液后溶液由藍(lán)色變?yōu)辄S色，在450nm處有最大吸光值。</span></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> 除了吸收波長(zhǎng)外，有些實(shí)驗(yàn)還需要設(shè)置一個(gè)校正波長(zhǎng)。校正波長(zhǎng)通常遠(yuǎn)離最大吸收波長(zhǎng)，作為背景吸收，消除氣泡、灰塵等系統(tǒng)誤差造成的“OD值”偏差。雙波長(zhǎng)校正以測(cè)得的“OD值”為基礎(chǔ)，可以有效降低系統(tǒng)誤差的影響。</span></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> 測(cè)得的待測(cè)樣本“OD值”仍然需要進(jìn)行折算才能得到最終濃度。很多科研人員經(jīng)常在這一步犯錯(cuò)，功虧一簣。需要注意的也比較簡(jiǎn)單，就是按照相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，使用推薦的曲線擬合方法進(jìn)行擬合。擬合完成后，需要查看擬合曲線的R2值。如果接近1，證明曲線擬合度越高，結(jié)果越可信。如果R2值偏低，則需要檢查是否存在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋問(wèn)題或?qū)嶒?yàn)操作失誤。選擇錯(cuò)??誤的擬合方法會(huì)影響曲線擬合度，R2值偏低，回歸計(jì)算出的待測(cè)樣本濃度也會(huì)不準(zhǔn)確。</span></div>
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<div><span style="font-size: 12px;"> <strong>溫馨提示</strong>：BCA蛋白定量實(shí)驗(yàn)及ELISA實(shí)驗(yàn)的顯色過(guò)程受反應(yīng)時(shí)間、溫度等條件影響，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況及時(shí)終止實(shí)驗(yàn)才能讀數(shù)。</span></div>
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