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別忽視 ELISA 洗滌！這可能是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵

ELISA檢測(cè)的關(guān)鍵點(diǎn)之一是洗滌步驟。洗滌能去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，否則這些抗體會(huì)在后續(xù)步驟中與底物反應(yīng)，產(chǎn)生非特異性信號(hào)，從而抬高背景值。每個(gè)步驟之間的洗滌確保只有與目標(biāo)抗原特異性結(jié)合的酶標(biāo)抗體被保留在微孔中，使最終的顯色反應(yīng)只反映目標(biāo)抗原的含量。洗滌不充分會(huì)導(dǎo)致重復(fù)孔之間結(jié)果的變異系數(shù)增大(例如，>10%)，以及背景吸光度值顯著高于空白對(duì)照(例如，>0.2)，高的背景信號(hào)會(huì)掩蓋真實(shí)的信號(hào)，導(dǎo)致假陽性或低估目標(biāo)抗原的濃度，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。  <img src="/images/upload/Image/ELISA檢測(cè)基本步驟.jpg" alt="ELISA洗滌步驟" width="391" height="332" />     做ELISA實(shí)驗(yàn)，洗板有2種方法：手動(dòng)洗板和洗板機(jī)洗板。兩者沒有本質(zhì)區(qū)別，只要操作符合要求，就能得到正確可靠結(jié)果。<o:p></o:p>   <h3>    手動(dòng)洗板<o:p></o:p></h3>       手動(dòng)洗板人為因素較大，實(shí)驗(yàn)人員必須經(jīng)驗(yàn)豐富，洗板次數(shù)要充足，沖擊力不宜過大。洗板液加入量以剛好填滿反應(yīng)孔為宜，防止孔內(nèi)游離酶被沖走，同時(shí)防止液體跨孔流動(dòng)。洗板后擦干也非常重要，否則可能造成假陽性。每次洗板后，用吸水紙輕輕拍干。垂直握持板子，避免交叉感染。用力不宜過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫落；吸水紙應(yīng)一次性使用，且最好使用不易脫落碎屑的吸水紙。酶結(jié)合物不耐干燥，尤其在較高溫度下更容易失活。因此，拍干的反應(yīng)板應(yīng)盡量縮短暴露在空氣中的時(shí)間，時(shí)間越長，吸光度值越低。<o:p></o:p>       手動(dòng)操作有浸泡、流水沖洗兩種方式：<o:p></o:p>       浸泡清洗<o:p></o:p>       1.吸干或旋轉(zhuǎn)干燥孔內(nèi)的反應(yīng)溶液；<o:p></o:p>       2.用洗滌液清洗一次（將洗滌液注滿孔內(nèi)，然后倒掉）；<o:p></o:p>       3、浸泡，即將洗液注滿板孔，靜置1～2分鐘，間歇搖晃，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；<o:p></o:p>       4.吸干孔內(nèi)的液體。徹底吸干，可以使用水泵或真空泵，也可以將液體抖掉，然后用干凈的毛巾或吸水紙拍干；<o:p></o:p>       5.重復(fù)步驟3和4，洗滌3至4次（或按說明書規(guī)定）。間接法中，如果背景較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時(shí)間。<o:p></o:p>       微量滴定板多采用浸泡洗滌法，洗滌液多為含有非離子去垢劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水的，非離子去垢劑同時(shí)含有疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)，疏水基團(tuán)通過疏水鍵與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合。親水基團(tuán)與水分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)重新回到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。<o:p></o:p>       洗滌液中的非離子去垢劑通常為Tween20，其濃度可在0.05%～0.2%之間，高于0.2%時(shí)可使包被在固相上的抗原或抗體解吸，降低檢測(cè)靈敏度。<o:p></o:p>       流水沖洗型<o:p></o:p>       流水沖洗法最初用于清洗珠子載體，洗滌液只有蒸餾水甚至自來水。洗滌時(shí)會(huì)附加一個(gè)特殊的裝置，使珠子在流水的沖擊下不斷翻滾沖洗。持續(xù)沖洗2分鐘后，吸收液體，再在蒸餾水中浸泡2分鐘，吸干。浸泡式就像浴缸，流水沖洗式就像淋浴。清潔效果更徹底，也更簡便快捷。<o:p></o:p>       實(shí)驗(yàn)證明，流水沖洗同樣適用于清洗酶標(biāo)板。清洗時(shí)，盡量加大水流量或增加水壓，使水流沖擊到板孔表面，清洗效果會(huì)更好。<o:p></o:p>   <h3>    洗板機(jī)<o:p></o:p></h3>       洗版機(jī)洗版人為因素少，速度快，條件恒定。但是，使用洗版機(jī)洗版時(shí)應(yīng)注意以下三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。<o:p></o:p>       洗滌參數(shù)<o:p></o:p>       主要參數(shù)是洗滌液體積。自動(dòng)洗板機(jī)分配洗滌液。如果您之前遇到過高背景，請(qǐng)毫不猶豫地將洗滌液體積設(shè)置為較高，最好高于包被體積。洗滌液太少會(huì)導(dǎo)致部分分析表面未被清洗，從而顯著增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌液體積必須相同。<o:p></o:p>       洗滌時(shí)間<o:p></o:p>       影響洗滌結(jié)果的主要參數(shù)是洗滌次數(shù)。當(dāng)然，洗滌次數(shù)越多，背景越低。然而，洗滌次數(shù)過多會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度，導(dǎo)致難以測(cè)量。通常的做法是每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。但一般來說，包被板所需的洗滌次數(shù)比用戶包被板要少。對(duì)于用戶包被的ELISA板，必須優(yōu)化洗滌次數(shù)。<o:p></o:p>       控制洗滌量和次數(shù)的另一種方法是添加過量的洗滌液。通常，96孔板的每個(gè)孔可容納330至460µl的洗滌液。然而，一些自動(dòng)洗板機(jī)可以編程分配遠(yuǎn)高于此量的洗滌液，例如1ml。具體怎么做呢？其實(shí)很簡單，只需在分配液體時(shí)打開抽吸功能即可。換句話說，當(dāng)分配器分配更多液體時(shí)，抽吸器也會(huì)將液體抽出。這項(xiàng)技術(shù)可以提高洗滌容量，而不會(huì)將液體濺到其他孔中。<o:p></o:p>       還有一些參數(shù)會(huì)影響清洗步驟的性能。這些參數(shù)包括吸液高度和吸液位置，兩者都可以調(diào)整，以減少背景（殘留）和差異。<o:p></o:p>       殘留液體含有未結(jié)合的抗原或抗體，可能會(huì)增加背景信號(hào)。殘留量越少，剩余液體越少，轉(zhuǎn)移到下一步驟的干擾液體也就越少。<o:p></o:p>       吸液高度會(huì)顯著影響殘留量，清洗吸頭與反應(yīng)孔底部距離稍大，殘留量會(huì)急劇增加；反之，清洗吸頭緊貼反應(yīng)孔底部，也會(huì)降低吸液效率，殘留量增加。<o:p></o:p>       目前洗板機(jī)通常使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動(dòng)。浮動(dòng)洗頭的吸頭在清洗過程中可以自由上下移動(dòng)，而剛性洗頭則固定不動(dòng)。使用剛性洗頭的清洗操作優(yōu)化起來更加復(fù)雜，因?yàn)槟枰浅Ｗ屑?xì)地調(diào)整吸頭高度。如果您的實(shí)驗(yàn)室使用多塊不同的板，這可能會(huì)非常耗時(shí)。使用浮動(dòng)洗頭時(shí)，吸頭會(huì)下降到反應(yīng)孔的底部。<o:p></o:p>       吸液位置對(duì)殘留量也有顯著影響；如果每個(gè)孔只使用一個(gè)吸液點(diǎn)（由于速度更快，這種情況很常見），則需要優(yōu)化吸液位置。最佳位置取決于洗頭的特性，但很少位于反應(yīng)孔的中間，盡管這是所有洗頭最常見的默認(rèn)位置。一般來說，最佳位置位于孔的中間和孔壁之間。<o:p></o:p>       反應(yīng)孔的形狀也會(huì)影響殘留量。C形底部（平底、圓角）的微孔板的殘留量通常低于平底、尖角的微孔板。<o:p></o:p>

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