RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)5大注意事項(xiàng)

<p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)看似簡(jiǎn)單，卻常常因?yàn)橐恍┘?xì)節(jié)問題導(dǎo)致結(jié)果不理想，甚至實(shí)驗(yàn)失敗。本文將揭示RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中常見的5大誤區(qū)，幫助您避開這些陷阱，獲得高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 1.防止RNA模板降解</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 毫無疑問，RNA的質(zhì)量對(duì)cDNA合成的結(jié)果有著重要的影響。但RNA本身比較脆弱，容易降解。為了保證RNA的完整性，需要謹(jǐn)慎小心，例如在冰上操作、減少操作時(shí)間等。在反應(yīng)體系中添加抑制劑也能有效防止RNA降解。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 另外，建議在逆轉(zhuǎn)錄前通過瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA條帶的質(zhì)量。通常完整的真核RNA應(yīng)該包含28S和18S條帶，且28S條帶的強(qiáng)度一般約為18S的兩倍。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 2.RNA定量</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 除了掌握RNA的完整性外，逆轉(zhuǎn)錄前還需要測(cè)定RNA的濃度。一般逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)上樣量都有要求，建議總RNA上樣量小于5&mu;g。超過此范圍會(huì)造成逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的偏向性（表達(dá)豐度高的基因優(yōu)先被逆轉(zhuǎn)錄），從而導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 3.去除基因組DNA污染</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 殘留的基因組DNA（gDNA）會(huì)嚴(yán)重干擾熒光定量結(jié)果。為了使結(jié)果更真實(shí)、可重復(fù)，需要去除gDNA干擾?？梢栽谝镌O(shè)計(jì)時(shí)避免gDNA擴(kuò)增，例如將上下游引物設(shè)置在不同的外顯子上；或在RNA提取后使用DNaseI去除gDNA。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 4.選擇合適的引物</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; OligodT引物和隨機(jī)引物均可進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。OligodT引物僅能結(jié)合mRNA3'端的poly(A)，不受rRNA和tRNA的干擾，特異性強(qiáng)。但其對(duì)RNA的完整性和二級(jí)結(jié)構(gòu)要求較高，不適用于原核生物。隨機(jī)引物幾乎可以結(jié)合任何RNA，包括mRNA、tRNA和rRNA，具體取決于堿基。但隨機(jī)引物法逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的片段較小，難以獲得全長轉(zhuǎn)錄本的cDNA。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 5.逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 逆轉(zhuǎn)錄酶在整個(gè)逆轉(zhuǎn)錄體系中起著關(guān)鍵作用。除了活性之外，逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性也至關(guān)重要。在較高溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄可以降低RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高逆轉(zhuǎn)錄效率。野生型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶非常&ldquo;耐熱&rdquo;，當(dāng)溫度高于37℃時(shí)，其穩(wěn)定性會(huì)大大降低。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的成功與否，往往取決于細(xì)節(jié)。牢記這5大注意事項(xiàng)，讓您的PCR實(shí)驗(yàn)事半功倍，高效獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)。</span></p>