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ELISA檢測方法步驟

ELISA是一種用于檢測和定量蛋白質(zhì)、抗體、抗原的免疫學(xué)方法，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和診斷中。然而，對于剛接觸ELISA新手來說，復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟和細(xì)節(jié)常常讓他們感到困惑。接下來，我們將逐步講解ELISA的操作步驟。  <img src="/images/upload/Image/5(47).png" alt="酶聯(lián)生物ELISA試劑盒" width="500" height="375" /> <h3>　　實(shí)驗(yàn)步驟<o:p></o:p></h3>   　　 一、實(shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備<o:p></o:p>   　　1.抗原/抗體:根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮?lt;/font>ELISA類型(例如夾心法、間接法、競爭法)，選擇合適的抗原或抗體。<o:p></o:p>   　　2.96孔板:高結(jié)合力的聚苯乙烯微孔板，用于吸附抗原或抗體。<o:p></o:p>   　　3.酶標(biāo)二抗:與目標(biāo)抗體/抗原結(jié)合的酶標(biāo)二抗，例如辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的二抗。<o:p></o:p>   　　4.封閉液:用于封閉微孔板未結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性結(jié)合。常用5%BSA（牛血清白蛋白）PBS溶液或脫脂奶粉PBS溶液。<o:p></o:p>   　　5.酶底物:用于與酶標(biāo)二抗上的酶反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測的信號。HRP常用TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺），AP常用pNPP（對硝基苯磷酸）。<o:p></o:p>   　　6.酶反應(yīng)終止液:用于終止酶促反應(yīng)。HRP常用2N硫酸溶液。<o:p></o:p>   　　7.洗滌液:用于洗滌未結(jié)合的抗體或抗原，常用0.05%PBST(PBS溶液+0.05%Tween20)。<o:p></o:p>   　　8.樣品稀釋液:根據(jù)樣品的不同，選擇合適的稀釋液。<o:p></o:p>   　　9.標(biāo)準(zhǔn)品(可選):如果需要進(jìn)行定量分析，則需要準(zhǔn)備一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。<o:p></o:p>   　　二、實(shí)驗(yàn)步驟 <o:p></o:p>   　　1.包被抗體/抗原<o:p></o:p>   　　配制合適濃度的抗原或抗體（通常1-10µg/mL），濃度需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）稀釋。<o:p></o:p>   　　向96孔板中每孔加入合適的體積（例如50-200µ）稀釋好的抗原或抗體溶液。<o:p></o:p>   　　在4°C或37°C孵育過夜或2小時(shí)，讓抗原/抗體吸附到板子上。孵育時(shí)間和溫度需要根據(jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化。<o:p></o:p>   　　三、洗板<o:p></o:p>   　　用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗板，重復(fù)以下步驟3-5次，或根據(jù)需要增加洗滌次數(shù)，以確保充分去除未結(jié)合的物質(zhì)：<o:p></o:p>   　?、?、棄去孔內(nèi)液體。<o:p></o:p>   　　②、用足量的洗滌液(例如200-300µL/孔)充滿每孔。<o:p></o:p>   　?、邸㈧o置1-2分鐘。<o:p></o:p>   　　④、棄去洗滌液，并用吸水紙小心拍干板子，避免交叉污染。<o:p></o:p>   　　四、封閉<o:p></o:p>   　　每孔加入200µL封閉液，例如1%-5%BSA或脫脂奶粉的PBS/PBST溶液。在室溫下孵育1-2小時(shí)，或4°C過夜孵育。孵育結(jié)束后，進(jìn)行洗板操作：<o:p></o:p>   　?、?、棄去孔內(nèi)液體。<o:p></o:p>   　?、?、用洗滌液(例如0.05%PBST)注滿每孔。<o:p></o:p>   　　③、靜置1-2分鐘。<o:p></o:p>   　?、?、棄去洗滌液，并用吸水紙小心拍干板子，避免交叉污染。重復(fù)洗板步驟3-5次。<o:p></o:p>   　　五、加樣品或標(biāo)準(zhǔn)品<o:p></o:p>   　　使用樣品稀釋液或標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（通常與封閉液成分相同）按照合適的稀釋梯度（例如2倍、3倍、5倍等）稀釋待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。對于定量ELISA，需要準(zhǔn)備一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行梯度稀釋，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。<o:p></o:p>   　　每孔加入100µL稀釋后的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。設(shè)置空白對照孔，不加樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，只加稀釋液。<o:p></o:p>   　　在室溫下孵育1-2小時(shí)，或37°C孵育30-60分鐘。孵育時(shí)間和溫度需要根據(jù)具體的抗原抗體進(jìn)行優(yōu)化。<o:p></o:p>   　　六、加檢測抗體（對于夾心法）<o:p></o:p>   　　孵育完樣品后，進(jìn)行洗板操作：<o:p></o:p>   　?、?、棄去孔內(nèi)液體。<o:p></o:p>   　　②、用洗滌液(例如0.05%PBST)充滿每孔。<o:p></o:p>   　?、邸㈧o置1-2分鐘。<o:p></o:p>   　　④、棄去洗滌液，并用吸水紙小心拍干板子，避免交叉污染。重復(fù)洗滌步驟3-5次。<o:p></o:p>   　?、荨⒓尤胗每贵w稀釋液(通常與封閉液成分相同)稀釋好的檢測抗體(結(jié)合靶標(biāo)抗原的酶標(biāo)抗體)，每孔100µL。抗體的稀釋倍數(shù)需要根據(jù)具體的抗體和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。<o:p></o:p>   　?、?、在室溫或37°C下孵育1-2小時(shí)。具體孵育時(shí)間和溫度需要根據(jù)具體的抗體進(jìn)行優(yōu)化。<o:p></o:p>   　?、?、孵育結(jié)束后，再次進(jìn)行洗板操作(步驟同上)。<o:p></o:p>   　　七.加酶標(biāo)二抗<o:p></o:p>   　　使用抗體稀釋液（通常與封閉液成分相同）稀釋酶標(biāo)二抗。加入稀釋好的酶標(biāo)二抗（結(jié)合檢測抗體的酶標(biāo)抗體），每孔100µL。二抗的稀釋倍數(shù)需要根據(jù)具體的抗體和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。<o:p></o:p>   　　在室溫或37°C下孵育30分鐘至1小時(shí)。具體孵育時(shí)間和溫度需要根據(jù)具體的二抗進(jìn)行優(yōu)化。<o:p></o:p>   　　孵育結(jié)束后，進(jìn)行洗板操作：<o:p></o:p>   　?、?、棄去孔內(nèi)液體。<o:p></o:p>   　?、?、用洗滌液(例如0.05%PBST)充滿每孔。<o:p></o:p>   　　③、靜置1-2分鐘。<o:p></o:p>   　?、?、棄去洗滌液，并用吸水紙小心拍干板子，避免交叉污染。重復(fù)洗板步驟3-5次。<o:p></o:p>   　　八.加底物反應(yīng)<o:p></o:p>   　　根據(jù)試劑盒說明書準(zhǔn)備酶底物溶液。加入100µL酶底物溶液（如TMB）到每孔，避光反應(yīng)一段時(shí)間，通常為5-30分鐘，或直至出現(xiàn)明顯的顏色變化(例如，對于TMB底物，顏色會從無色變?yōu)樗{(lán)色)。密切觀察顯色情況，并根據(jù)試劑盒說明書和標(biāo)準(zhǔn)品的顯色情況來確定反應(yīng)時(shí)間。<o:p></o:p>   　　九.終止反應(yīng)<o:p></o:p>   　　根據(jù)試劑盒說明書加入終止液，以終止反應(yīng)，停止底物顯色反應(yīng)。顏色變化取決于所使用的底物。例如，使用TMB底物時(shí)，加入2N硫酸后，顏色會從藍(lán)色變?yōu)辄S色。<o:p></o:p>   　　十.測定吸光值<o:p></o:p>   　　使用已校準(zhǔn)的酶標(biāo)儀，根據(jù)試劑盒說明書選擇合適的檢測波長和參考波長，讀取各孔的吸光值（OD值）。讀取吸光值后，需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，例如繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算樣品濃度等。<o:p></o:p>   <h3>　　實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：<o:p></o:p></h3>   　　1.重復(fù)性：進(jìn)行足夠的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，例如至少三個(gè)技術(shù)重復(fù)（同一份樣品在同一塊板上進(jìn)行三次測定）或三個(gè)生物學(xué)重復(fù)（三個(gè)不同的樣品分別進(jìn)行測定）。技術(shù)重復(fù)可以評估實(shí)驗(yàn)的精確度，而生物學(xué)重復(fù)可以評估實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。<o:p></o:p>   　　2.溫度控制：在孵育階段，溫度對結(jié)果的影響較大。建議使用培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育，以獲得更精確的溫度控制。如果在室溫下孵育，則盡量保持穩(wěn)定的室溫，避免較大的溫度波動(dòng)。<o:p></o:p>   　　3.洗滌：每次洗板時(shí)，確保洗滌液完全覆蓋每個(gè)孔。洗滌時(shí)，可以輕輕拍打板子邊緣，以去除殘留液體，或使用洗板機(jī)進(jìn)行洗滌。注意避免交叉污染。<o:p></o:p>   　　4.顯色時(shí)間控制：顯色反應(yīng)時(shí)間對結(jié)果有很大影響。密切觀察顯色情況，并根據(jù)試劑盒說明書和標(biāo)準(zhǔn)品的顯色情況來確定最佳反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)明顯的梯度顏色變化時(shí)，即可終止反應(yīng)。<o:p></o:p>   　　5.試劑質(zhì)量：使用高質(zhì)量的試劑對于獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。<o:p></o:p>   　　6.操作規(guī)范：嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避免人為誤差。<o:p></o:p>   　　7.標(biāo)準(zhǔn)曲線：對于定量ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量直接影響樣品濃度的計(jì)算結(jié)果。確保標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，并選擇合適的擬合方法。<o:p></o:p>   　　上述是ELISA檢測方法步驟，ELISA實(shí)驗(yàn)操作包括包被、封閉、加樣、洗板、顯色等多個(gè)步驟。實(shí)驗(yàn)完成后，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和計(jì)算，可以準(zhǔn)確獲得樣品中的目標(biāo)分子濃度。在實(shí)驗(yàn)中要注意些事項(xiàng)。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和計(jì)算，下篇文章繼續(xù)為您介紹。<o:p></o:p>

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