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ELISA是什么檢測方法？一文帶你了解ELISA類型與方法

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是一種常用的實驗室免疫測定方法，用于檢測和定量各種生物樣本（例如血清、血漿、尿液、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等）中的目標(biāo)物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、肽、激素、抗體、等。   　　在ELISA檢測中，其核心原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合，以及酶的催化放大作用，來檢測和定量目標(biāo)物質(zhì)?？乖蚩贵w會被吸附到固相載體上，然后通過一系列的孵育和洗滌步驟，最終通過酶催化底物顯色來實現(xiàn)檢測。<o:p></o:p>   <h3>　　ELISA檢測階段：<o:p></o:p></h3>   　　包被/捕獲：包被步驟的目的是將能夠特異性結(jié)合待測分子的物質(zhì)固定在96孔板表面。如果待測分子是抗原，則使用捕獲抗體進(jìn)行包被；如果待測分子是抗體，則使用抗原進(jìn)行包被。<o:p></o:p>   　　板封閉：在包被步驟之后，使用封閉液覆蓋96孔板的剩余表面，以阻斷非特異性結(jié)合位點，從而降低背景信號并提高信噪比。常用的封閉劑包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、酪蛋白和明膠等。選擇合適的封閉劑取決于具體的ELISA體系和待測物質(zhì)，需要進(jìn)行優(yōu)化以避免干擾抗原抗體反應(yīng)。<o:p></o:p>   　　檢測：將待測抗體加入到包被有抗原的ELISA板中孵育，然后洗滌。接下來，加入酶標(biāo)記的二抗，該二抗能夠特異性地結(jié)合待測抗體。孵育后洗滌，最后加入底物顯色，通過顏色深淺判斷待測抗體含量。<o:p></o:p>   　　信號測量：使用平板讀取器讀取目標(biāo)抗原和抗體之間反應(yīng)產(chǎn)生的信號量。獲得的數(shù)據(jù)可以是定量的、半定量的和定性的。在定量研究中，濃度結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖，將光密度與對數(shù)濃度進(jìn)行比較。<o:p></o:p>   <h2>　　ELISA類型<o:p></o:p></h2>   <h3>　　直接ELISA<o:p></o:p></h3>   　　直接ELISA法將抗原固定在聚苯乙烯微孔板，然后使用蛋白質(zhì)（牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、酪蛋白和明膠）封閉未結(jié)合的位點，孵育后洗滌。<o:p></o:p>   　　在該檢測中，一抗是直接偶聯(lián)了酶的，加入底物，酶催化底物顯色，通過顏色深淺判斷抗體含量。由于步驟較少，直接ELISA是一種快速的實驗室工作流程技術(shù)，還可消除二抗交叉反應(yīng)。缺點是反應(yīng)明敏度低且成本較高。<o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/直接ELISA.png" alt="直接ELISA" width="500" height="174" /> <h3>　　間接ELISA<o:p></o:p></h3>   　　間接ELISA與直接ELISA在包被、封閉和顯色步驟上相似，主要區(qū)別在于檢測方式。間接ELISA使用兩種抗體：未標(biāo)記的特異性一抗和酶標(biāo)記的二抗。<o:p></o:p>   　　將抗原固定在聚苯乙烯微孔板，然后使用蛋白質(zhì)（牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、酪蛋白和明膠）封閉未結(jié)合的位點。加入待測抗體（一抗），孵育后洗滌，然后加入酶標(biāo)記的二抗（例如HRP或AP標(biāo)記的抗人IgG抗體），該二抗能夠特異性地識別一抗。孵育后洗滌。<o:p></o:p>   　　加入底物，酶催化底物顯色，通過顏色深淺判斷抗體含量。<o:p></o:p>   　　間接ELISA的優(yōu)點是成本較低，靈敏度更高。但是由于二抗，在檢測過程可能會發(fā)生交叉反應(yīng)。<o:p></o:p>   <h3>　　夾心elisa<o:p></o:p></h3>   　　夾心ELISA用于檢測抗原，其原理是將抗原“夾”在捕獲抗體和檢測抗體之間。首先，將捕獲抗體包被在微孔板表面。捕獲抗體能夠特異性地結(jié)合待測抗原上的一個表位。包被后，使用封閉液（例如BSA）封閉未結(jié)合的位點，以減少非特異性結(jié)合。孵育后，充分洗滌微孔板。然后，將待測抗原加入微孔板中，并孵育一段時間（例如37°C，1-2小時，具體時間需要優(yōu)化）。孵育后，再次充分洗滌微孔板，以去除未結(jié)合的抗原。接下來，加入酶標(biāo)記的檢測抗體，該抗體能夠特異性地結(jié)合待測抗原上的另一個表位。孵育后，再次充分洗滌微孔板，以去除未結(jié)合的檢測抗體。最后，根據(jù)酶標(biāo)記的類型選擇合適的底物（例如，HRP常用的底物是TMB）。加入底物后，酶催化底物顯色，使用酶標(biāo)儀讀取吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算抗原濃度。<o:p></o:p>   　　夾心ELISA法靈敏度高，但其主要缺點是檢測過程耗時費(fèi)力。此外，需要找到完美的抗原抗體對也是該檢測法的一個限制。 <img src="/images/upload/Image/夾心ELISA.png" alt="夾心ELISA" width="500" height="311" /><o:p></o:p>   <h3>　　競爭法ELISA<o:p></o:p></h3>   　　競爭法ELISA用于檢測樣本中是否存在抗原特異性抗體。其原理是待測抗體與酶標(biāo)記的抗體競爭結(jié)合有限數(shù)量的抗原。<o:p></o:p>   　　將抗原固定在聚苯乙烯微孔板，然后使用蛋白質(zhì)（牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、酪蛋白和明膠）封閉未結(jié)合的位點。 將待測抗體和酶標(biāo)記的抗體（競爭抗體）混合后加入微孔板中。待測抗體和競爭抗體競爭結(jié)合包被在板子上的抗原。孵育洗滌。加入底物，酶催化底物顯色，顏色越深，表示待測抗體含量越低；顏色越淺，表示待測抗體含量越高。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，可以定量測定待測抗體的濃度。<o:p></o:p>   　　該方法不適用于經(jīng)過任何程度稀釋的樣本，靈敏度較低。但是，該方法具有許多優(yōu)點，例如，對樣本純化的要求較低、變異性較小，并且可以分析樣本中的多種抗原。 <img src="/images/upload/Image/競爭ELISA.png" alt="競爭ELISA" width="500" height="200" /><o:p></o:p>   <h2>　　常見ELISA檢測方法<o:p></o:p></h2>   　　目前有許多檢測方法來研究抗原抗體復(fù)合物之間的反應(yīng)，例如比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法和顯色法。但下面介紹其中最常見的三種方法。<o:p></o:p>   <h3>　　化學(xué)發(fā)光分析<o:p></o:p></h3>   　　該技術(shù)利用過氧化物酶偶聯(lián)檢測抗體，如HRP和AP。以魯米諾溶液為底物，形成反應(yīng)產(chǎn)物，發(fā)射出可見光子，然后用光度計讀取。<o:p></o:p>   　　與其他檢測方法相比，該技術(shù)超靈敏，動態(tài)范圍更廣，甚至可以檢測到給定樣本中最少量的分析物。<o:p></o:p>   <h3>　　顯色測定<o:p></o:p></h3>   　　顯色法是最常見的ELISA檢測方法之一。它涉及使用辣根過氧化物酶(HRP-)或堿性磷酸酶(AP-)標(biāo)記的抗體與顯色底物（例如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液）結(jié)合使用。<o:p></o:p>   　　該技術(shù)利用反應(yīng)的吸光度來確定讀數(shù)，用于比較樣品或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測感興趣分子的濃度。<o:p></o:p>   <h3>　　熒光分析<o:p></o:p></h3>   　　該技術(shù)將過氧化物酶偶聯(lián)檢測抗體（如HRP和AP）與熒光底物相結(jié)合，后者在暴露于特定光波長時會發(fā)出熒光。即使在分析物濃度較高的情況下，信號也不會飽和，從而提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。<o:p></o:p>   　　通過本文elisa是什么檢測方法介紹，對ELISA檢測方法有所認(rèn)識。認(rèn)識ELISA檢測方法，對于日后ELISA實驗檢測至關(guān)重要。希望本文內(nèi)容能夠幫助您在未來實驗取得更大的成功。<o:p></o:p>

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